药典方案集锦丨应对 2025 版通则聚山梨酯 80 测定法修订，安捷伦带你轻松应对辅料分析难题

聚山梨酯是由脂肪酸、山梨坦和环氧乙烷经酯化、聚合而成，最常见的是聚山梨酯 20 和聚山梨酯 80（如图 1）。聚山梨酯具有较好的生物相容性和低毒性，常在药物制剂中作增溶剂和乳化剂。近年来，随着制药和生物制药的快速发展，辅料对药品安全性的影响日益受到重视，聚山梨酯具有一定的生物和药理活性，出于用药安全的考虑，会严格控制其在药物制剂中的含量^[1]。

图 1. 聚山梨酯 20（R=月桂酸酰基）和聚山梨酯 80（R=油酸酰基）的结构式

最 新 2025 版药典四部通则 3203《聚山梨酯 80 测定法》在原来比色法的基础上增加了第二法荧光胶束法。原有比色法用到铵钴硫氰酸盐和二氯甲烷，具有一定的毒性，环境不友好，且需要复杂的样品前期准备和处理，而新增的第二法荧光胶束法（HPLC-FLD）采用液相色谱系统内衍生反应，无需样品前处理，无需色谱柱分离，整个检测过程在 2 分钟之内完成，简单高效，非常适合生物制品及其他药物制剂中聚山梨酯含量的准确测定。

通则 3203《聚山梨酯 80 测定法》

第二法荧光胶束法

荧光胶束法基于一种疏水荧光染料 N- 苯基 -1- 萘胺（NPN）可与聚山梨酯胶束的非极性疏水性内核结合，这种聚山梨酯胶束 -NPN 复合物的荧光强度与聚山梨酯胶束浓度呈正相关，因此可以对聚山梨酯进行定量测定。

参考 25 版药典的方法，我们设置了如下的 HPLC-FLD 的液相分析方法：

在此条件下，聚山梨酯 80 在 2 min 之内出峰，峰形较好（图 2），且峰面积稳定（如图 3），而且在高浓度进样后，系统没有任何残留影响。

图 2. 聚山梨酯 80 的色谱图

图 3. 重复进样 10 针聚山梨酯的色谱图

同时我们进不同浓度的聚山梨酯 80 的对照品溶液，在 0.3 – 1.1 mg/ml 浓度范围内线性相关性好（图 4）。

图 4.  聚山梨酯标准曲线，线性范围 0.3-1.1 mg/ml，R2=0.9998

对实际单抗制剂中聚山梨酯 80 的含量进行了准确测定，我们看到实际制剂样品的峰面积的重复性数据特别好。虽然是在衍生管中进行快速的衍生反应，但是衍生的效果稳定且可靠，未受到制剂中高浓度抗体的影响。考虑到有些实验室环境温度变化较大的情况下，可以在衍生管前后加上预加热器，使衍生过程更稳定。

表 1. 三个单抗供试品中聚山梨酯 80 峰面积重复性数据

在 HPLC-FLD 方法建立之初，中检院俞小娟等老师对于 HPLC-FLD 法测定聚山梨酯 80 含量的方法学进行了联合验证^[2]，参考文献的结果，大家可以在安捷伦各种型号的液相上放心使用该方法对聚山梨酯 80 或 20 进行准确检测分析。

最 后，在看似简单的 HPLC-FLD 分析过程中，有几个实验细节和小伙伴一起分享：

流动相临用现配，避光保存；对照品溶液临用现配；

系统平衡：需用高浓度聚山梨酯 80 质控标准品（1 mg/ml）进样至少 20 针平衡系统；

标准品来源：需用与添加原料同批次同厂家的聚山梨酯 80 作为标准品；

高浓度蛋白干扰：当蛋白浓度较高（>20mg/ml）时，出现回收率超限的情况，建议前处理去除蛋白或者样品稀释。

结语

安捷伦提供生物制药辅料的液相分析解决方案文集^[3]，内容非常丰富。既对现有聚山梨酯的分析方案进行了拓展，包括采用 HPLC-ELSD 的方法对不同蛋白药物制剂中的聚山梨酯 80 或者 20 进行准确的含量分析，同时收录了更多的目前生物制药行业制剂中用到的辅料，包括泊洛沙姆 P188，糖类和氨基酸类的分析方法，以及在细胞和基因治 疗、核酸药物和疫苗中的递送载体和佐剂的分析方案。

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参考文献：

^[1] 徐明明，程菁，吴利红等.HPLC-荧光法测定单抗药物中聚山梨酯的含量[J]. 中国医药工业杂志, 2019, 50(9):1047-1051 DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2019.09.016

^[2] 俞小娟，于传飞，张荣建等.HPLC-FMA法测定单抗药物中聚山梨酯80含量的方法学联合验证[J]. 药学学报,2021,56(8): 2276-2281 DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0151

^[3] 安捷伦生物制药辅料、载体及生产工艺残留分析解决方案（第二版）,安捷伦科技公司应用简报，出版号：5994-4672ZHCN, 2022

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